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系统稳定灵敏检测长时程记录探针兼容定量分析

系统稳定

系统自身稳定性极高，设备状态波动不引入偏差，数据纵向可比

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荧光寿命概述

什么是荧光寿命

荧光寿命（Fluorescence Lifetime, τ）是指荧光分子在激发态停留的平均时间。与荧光强度不同，荧光寿命不依赖于荧光分子浓度和激发光强度，而是直接反映分子释放量、分子构象变化以及所处的微环境等。荧光寿命能够区分不同寿命组分的占比，并可灵敏探测荧光寿命的微弱变化，为在体研究提供更稳定、更特异的量化指标。

图1. 荧光寿命原理图。 荧光寿命（τ）指荧光分子在激发态停留的平均时间

为什么选择荧光寿命？

与传统荧光强度不同，荧光寿命是荧光分子的固有物理属性，不受探针表达量、光漂白及运动噪声的影响。这带来以下核心优势：

• 定量、跨样本可比 —— 无需归一化至基线

• 长时程稳定记录 —— 适用于睡眠、慢性疾病模型及纵向研究

• 灵敏检测脑内物质水平动态变化 —— 基于荧光寿命探针实现

两种主流测量方法

时域法

时域法通过脉冲光源激发样品，直接记录荧光衰减的时间过程。最常用的实现方式是时间相关单光子计数（TCSPC）：测量每个光子从激发脉冲到被探测之间的时间差，构建衰减直方图，再通过指数拟合提取寿命值。时域法时间分辨率高，能够对单个光子进行计时，在低光子通量条件下通常具有更优的信噪比，并可高精度地分辨多指数衰减中的各个寿命组分。

频域法

频域法使用正弦调制的连续光源激发样品，通过测量发射光相对于激发光的相位延迟和调制深度来推算荧光寿命。频域法系统相对简单，成像速度快，且无需昂贵的脉冲激光器，尤其适合高光子通量样品的高速宽场成像。

图2. 时域法（TCSPC）与频域法原理示意图^[1]。（a）TCSPC：脉冲激发与荧光衰减，寿命（τ）定义为衰减至1/e的时间。（b）光子到达时间直方图及IRF（绿）与拟合曲线（红虚线）。（c）频域：正弦调制激发与相位延迟发射。（d）不同寿命下的调制与相位随频率变化。

两种方法如何选择

时域法（TCSPC）时间分辨率更高，能够对单个光子进行计时，对弱荧光样品可提供更优的信噪比，并能高精度地拆分多个寿命组分；

频域法采集速度更快，对高光子通量样品表现良好，且无需脉冲激光器即可实现。

k8凯发荧光寿命光纤记录系统采用业内公认"金标准"——时间相关单光子计数（TCSPC）技术，直接检测荧光寿命以反映脑内神经活动，支持小鼠在自由活动状态下进行长时间稳定记录。本系统可测量1至10纳秒范围内的荧光寿命，兼容市面上绝大多数荧光寿命探针，为神经科学在体研究提供稳定、可靠的定量观测方案。

应用场景

应用实例

荧光寿命光纤记录（FLiP）能够在自由活动动物中实现稳定、定量、跨样本可比的在体神经信号测量。以下三个实例展示了其在不同研究方向中的应用。

（一）跨动物、跨时间尺度的神经调质测量^[2]

华盛顿大学医学院的研究者系统评估了荧光寿命测量在神经调质传感器中的应用。研究发现，多种基于强度的传感器（如GRAB ACh3.0、GRAB 5-HT2h、GRAB NE2m、GRAB DA2m）同时具有荧光寿命响应，其中GRAB ACh3.0寿命动态范围最大。

作者利用FLiP在自由活动小鼠海马CA1区测量GRAB ACh3.0寿命与强度。结果显示，与强度不同，荧光寿命在激光功率波动、传感器表达水平差异及跨周龄表达变化下均保持稳定。合并不同条件的数据后，仅寿命能显著区分奔跑与静息、NREM与REM睡眠等行为状态。该研究证明荧光寿命是跨动物、跨时间尺度比较神经调质水平的可靠读出。

图3. GRAB ACh3.0的荧光寿命在不同激光功率和小鼠体内传感器表达水平变化的情况下，仍能准确反映运动与静息状态^[2]

（二）揭示精神疾病风险基因Akap11突变小鼠纹状体PKA活性异常^[3]

布罗德研究所等机构的研究者利用FLiP测量了精神分裂症与双相情感障碍风险基因Akap11突变小鼠纹状体中的PKA活性动态。

作者将PKA活性报告探针FLIM-AKAR表达于伏隔核，在自由活动小鼠中进行FLiP测量。结果显示，Akap11突变小鼠的PKA活性持续升高且跨周稳定；PKA不敏感突变体FLIM-AKAR T391A在各基因型间无差异。给予多巴胺受体拮抗剂后，D2拮抗剂进一步增强突变小鼠本已升高的PKA活性，D1拮抗剂对PKA活性的抑制在突变小鼠中更为显著。行为学上，突变小鼠对安非他明表现出异常持久的运动反应。该研究揭示Akap11缺失导致纹状体多巴胺与PKA信号异常，为精神疾病的多巴胺假说提供了分子机制证据。

图4. 荧光寿命光度法在Akap11突变小鼠中揭示了PKA活性持续升高以及纹状体环路的功能改变^[3]

（三）新型钙离子寿命探针LifeCamp实现瞬时与基线钙信号的绝对测量^[4]

哈佛医学院的研究者开发了新型绿色高速钙离子寿命探针LifeCamp，并在自由活动小鼠中验证了其性能。

作者利用FLIPR在腹侧被盖区（VTA）多巴胺神经元及伏隔核D1R、D2R型棘状投射神经元中测量LifeCamp寿命，发现VTA多巴胺神经元的基线钙水平显著高于伏隔核两类神经元。此外，LifeCamp可检测食物颗粒消耗与足部电击诱发的钙瞬变，并揭示重复摄食过程中基线钙的缓慢升降。该研究证明LifeCamp可在多种在体条件下实现基线钙与瞬时钙变化的绝对测量，为研究神经元活动的快慢动态提供了新工具。

图5. 在自由活动小鼠的VTA和NAC中测量LifeCamp^[4]

以上三个实例分别展示了荧光寿命光纤记录在跨动物跨时间尺度一致性验证、精神疾病风险基因机制研究及新型钙寿命探针开发与应用中的价值，共同表明荧光寿命光纤记录技术的独特优势，为在体神经信号的解析开辟了新的可能。